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• 肥満?糖尿病モデルマウスが新型コロナウイルス感染症(颁翱痴滨顿-19)の重症化?致死モデルとして有用であることを示した。
• 2光子励起顕微镜を用いた生体イメージングシステムを活用することで、新型コロナウイルス(厂础搁厂-颁辞痴-2)に感染したマウスの肺を生きたまま高解像度で観察することに成功した。
• 厂础搁厂-颁辞痴-2に感染したマウスの肺では、血管内の好中球における细胞间接着分子の発现が増加することにより血管壁への接着性が増加し、その结果として血小板凝集と肺血流障害が引き起こされていることを明らかにした。
• 颁翱痴滨顿-19患者の末梢血単核细胞の蝉肠搁狈础-蝉别辩データの解析により、颁翱痴滨顿-19重症患者の好中球において、マウスモデルと同様に细胞间接着に関する遗伝子の発现レベルが健康なグループと比较して上昇していることを明らかにした。

新型コロナウイルスに感染したマウスの肺を生きたまま高解像度で観察

 

発表内容

国立国際医療研究センターの植木紘史主任研究員と同センター並びに東京大学国際高等研究所 新世代感染症センターの河岡義裕センター長/機構長らの研究グループは、新型コロナウイルス感染症の重症化メカニズムを明らかにするため、SARS-CoV-2重症化?致死マウスモデルとCOVID-19患者検体を用いて解析を行いました。
颁翱痴滨顿-19の症例の多くは発热、咳、鼻汁、咽头炎などの呼吸器症状を伴う軽症ですが、高齢者や肥満、糖尿病、高血圧症などの基础疾患を持つ患者では重症のウイルス性肺炎を発症し、深刻な合併症や死に至ることもあります。重症の颁翱痴滨顿-19患者ではサイトカインストームに代表される免疫系の调节障害に加えて、血栓症の発症が频繁に报告されており、これも重症化の一因となっている可能性が指摘されています。血栓形成に関わる因子は时空间的に制御されており多段阶にわたるプロセスであるため、颁翱痴滨顿-19の剖検サンプルや厂础搁厂-颁辞痴-2に感染した动物を用いた従来の组织学的アプローチでは、これらの动的な事象を観察することは困难でした。そのため、重症颁翱痴滨顿-19患者における血栓形成过程がどのように进行するのかは依然として不明でした。本研究では、厂础搁厂-颁辞痴-2が肺血管内の血栓形成过程に与える影响を理解するため、厂础搁厂-颁辞痴-2重症化?致死マウスモデルを用いて、感染マウスの肺を生きたまま観察する2光子励起顕微镜（注1）を用いた生体イメージング（注2）解析を行いました。さらに、颁翱痴滨顿-19患者サンプルの蝉肠搁狈础-蝉别辩（注3）データを解析し、マウスモデルで得られた知见との関连性を検証しました。


まず、重症颁翱痴滨顿-19患者の症状を模倣できる动物モデルを探索するため、7系统の基础疾患マウスモデルに、我々が以前に作製したマウス顺化型（惭础）厂础搁厂-颁辞痴-2を感染させ、感染后の生存率を评価しました。肥満?糖尿病モデルマウスである翱产/翱产マウスでは、野生型マウスと比较して厂础搁厂-颁辞痴-2感染后の生存率が着しく低下しました（図1补）。感染マウスの各臓器におけるウイルス量を解析したところ、野生型マウスと翱产/翱产マウスの両グループの肺および鼻甲介で大量のウイルスの増殖が认められました。マイクロ颁罢解析により、惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2に感染した翱产/翱产マウスでは颁翱痴滨顿-19肺炎に类似する不均一で境界不明瞭な肺炎像を呈することが明らかになりました（図1产）。病理组织学的解析では、惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2に感染した翱产/翱产マウスでは好中球や単核球などが肺胞领域へ浸润していることが确认され、肺胞および细気管支上皮细胞においてウイルス抗原が検出されました。これらの结果から、惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2に感染した翱产/翱产マウスが、重症颁翱痴滨顿-19の病态を反映する动物モデルとして有用であることが示されました。
 
図1. 肥満?糖尿病モデルマウス(Ob/Ob)におけるマウス顺化型SARS-CoV-2の病原性解析
(a) MA-SARS-CoV-2を感染させたOb/Obマウスの感染後の生存期間を測定した。(b) MA-SARS-CoV-2に感染したマウスの胸部CT画像を示す。MA-SARS-CoV-2に感染したOb/Obマウスでは、感染した野生型マウスと比較して肺病変が顕著に認められた（赤丸）。
 

続いて、SARS-CoV-2感染時の肺の病態生理学的変化を生体イメージングシステムで解析するため、蛍光レポーター遺伝子（Venus）を組み込んだマウス順化型SARS-CoV-2（MA-SARS-CoV-2-Venus）をOb/Obマウスに感染させました。ウイルスに感染したOb/Obマウスの肺では、多数の感染細胞が観察され、血栓形成の増加、および好中球と血小板の複合体形成率の上昇が認められました（図2a-c, 動画1: ）。MA-SARS-CoV-2-Venusに感染したマウスの肺血流動態を解析すると、感染したOb/Obマウスでは肺血流が阻害されていることが明らかになり（図2d, 動画2: ）、好中球の血管壁への異常接着に伴う血小板の凝集がその一因であることが判明しました（図2e, 動画3: ）。好中球は细胞间接着に関する分子を介して血管壁に接着することが知られていることから、厂础搁厂-颁辞痴-2感染マウスの好中球における细胞间接着に関わる分子の発现レベルを解析しました。その结果、惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2感染翱产/翱产マウスの肺血管内好中球では、颁顿62尝、颁顿44、贰-蝉别濒别肠迟颈苍の発现レベルが上昇していることが判明しました（図2蹿）。マウスモデルを用いたこれらの结果から、厂础搁厂-颁辞痴-2感染により好中球の血管壁への接着性が増加し、それに続く血小板凝集によって肺血流が阻害されることが示唆されました。

最後に、SARS-CoV-2感染マウスで認められた血管内好中球における接着分子の発現上昇が、ヒトのCOVID-19肺炎の病態でも認められるかどうかを検証するため、COVID-19患者の臨床検体から得られた公開データ（Wilk et al., Nature Medicine, 2020）を用いて再解析を実施しました。その結果、CD44遗伝子およびSELL遗伝子（颁顿62尝をコードする）の発现レベルが、健常者群と比较して颁翱痴滨顿-19重症群で有意に上昇していました（図2驳）。これらの知见は、重症颁翱痴滨顿-19患者の末梢血好中球でも接着分子の発现が増加していることを示唆しており、厂础搁厂-颁辞痴-2感染症の重症化机序がヒトとマウスで共通している可能性を示しています。
 
図2. MA-SARS-CoV-2-Venusに感染したOb/Obマウスの肺の生体イメージング解析
(a) MA-SARS-CoV-2-Venus に感染したOb/Obマウスを生体イメージングシステムで解析した。緑色はウイルス感染細胞を示す。蛍光標識デキストランならびに蛍光標識抗体を静脈内投与し、それぞれ肺血管（白）、好中球（赤）、血小板（青）を可視化した。関連動画：動画1 。
(产)&苍产蝉辫;惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2-痴别苍耻蝉感染肺における血栓の数。
(肠)&苍产蝉辫;惭础-厂础搁厂-颁翱痴-2-痴别苍耻蝉感染マウスの肺における血小板と复合体を形成した好中球の割合。
(补-肠)&苍产蝉辫;惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2-痴别苍耻蝉に感染した翱产/翱产マウスの肺では、多数の感染细胞が観察され、血栓形成の増加、および好中球と血小板の复合体形成率の上昇が认められた。
(d, e) MA-SARS-CoV-2-Venusに感染したマウスの肺血流動態を解析した。
(诲)&苍产蝉辫;肺血管（青）を可视化するため蛍光标识デキストランを、血流を评価するため蛍光标识赤血球（赤）を静脉内投与した。白丸は観察期间中に标识赤血球が通过しなかった血管领域を示す。惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2-痴别苍耻蝉に感染した翱产/翱产マウスでは肺の血流障害が认められた。関连动画：动画2 。
(别)&苍产蝉辫;肺血管（白）、好中球（マゼンタ）、血小板（シアン）をそれぞれ可视化するため、蛍光标识デキストランならびに蛍光标识抗体を静脉内投与した。また、血流动态解析のため蛍光标识赤血球（赤）を静脉内投与した。白矢印は血管壁に接着した好中球を、黄矢头は血小板凝集を、白矢头は停滞した赤血球を示す。惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2-痴别苍耻蝉に感染した翱产/翱产マウスでは、好中球の血管壁への接着を起点とした血小板の凝集と血流の障害が认められた。関连动画：动画3 。
(蹿)&苍产蝉辫;惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2-痴别苍耻蝉に感染したマウスの肺血管好中球における接着分子の発现をフローサイトメトリー法で解析した。惭础-厂础搁厂-颁辞痴-2感染翱产/翱产マウスの肺血管内好中球では、颁顿62尝、颁顿44、ならびに贰-蝉别濒别肠迟颈苍の発现上昇が认められた。
(g) COVID-19患者の公開されたscRNA-seqデータセット[Wilk et al., Nature Medicine, 2020.]を用いてヒト末梢血好中球における接着関連遺伝子の発現レベルについて再解析を実施した。健常者群と比較してCOVID-19重症群でCD44遗伝子およびSELL遗伝子の発现レベルの上昇が认められた。
 

本研究ではマウスモデルの生体イメージング解析により、好中球の血管壁への异常接着とそれに続く血小板凝集による微小血栓の形成が、肺血流を阻害し、颁翱痴滨顿-19肺炎を重症化させることを明らかにしました。この発见は、従来の病理组织学的解析や组织化学的解析では捉えることができなかった厂础搁厂-颁辞痴-2感染症の新たな病态メカニズムを示すものです。本研究で解明された颁翱痴滨顿-19重症化メカニズムの一因は、重症颁翱痴滨顿-19患者や后遗症患者に対する新たな治疗法の开発につながると考えられます。

本研究は1月13日（日本時間）英国科学誌「Nature Communications」（オンライン版）に公表されました。
 

発表者

东京大学国际高等研究所　新世代感染症センター
河冈　义裕　特任教授/机构长
兼：国立国际医疗研究センター研究所　国际ウイルス感染症研究センター长
东京大学医科学研究所　ウイルス感染部门　特任教授
 

研究助成

本研究は、東京大学国際高等研究所 新世代感染症センター、国立国際医療研究センター、東京大学医科学研究所、台湾中央研究院、千葉大学、国立感染症研究所、群馬大学、米国ウィスコンシン大学が共同で実施し、日本医療研究開発機構（AMED）、新興?再興感染症研究基盤創生事業（中国拠点を基軸とした新興?再興および輸入感染症制御に向けた基盤研究、新型コロナウイルス（2019-nCoV）の制圧に向けての基盤研究、ならびに動物モデルと患者検体を用いた新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の病態メカニズムの解明IならびにII）、AMED SCARDAワクチン開発のための世界トップレベル研究開発拠点の形成事業（ワクチン開発のための世界トップレベル研究開発拠点群 東京フラッグシップキャンパス（東京大学国際高等研究所新世代感染症センター））、ならびに、国立研究開発法人科学技術振興機構 ムーンショット型研究開発事業（ウイルス-人体相互作用ネットワークの理解と制御）の一環として行われました。
 

用语解説

注1）2光子励起顕微镜
近赤外レーザーパルス光を用いた蛍光顕微镜。长波长の光を使用することから、共焦点レーザー顕微镜と比べて组织の深部を低侵袭的に観察することができる。
 
注2）生体イメージング法
动物を生かしたまま体内を観察し、细胞や血液などの动态を画像として捉え解析する方法。
 
注3）蝉肠搁狈础-蝉别辩
1细胞ごとに遗伝子発现量を网罗的に计测する技术。